28 de Julio de 2014
Artículo de divulgación

Nueva vacuna marcadora contra herpes virus bovino 1

Se ha desarrollado una nueva vacuna marcadora contra herpes virus bovino 1 en base a la cepa BoHV1?gEßgal capaz de inducir niveles similares de protección que la vacuna convencional pero con la ventaja adicional de permitir la diferenciación serológica entre animales infectados y vacunados

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AUTORES: S. A. Romera*; M. Puntel*; V. Quattrocchi; P. Del Medico; P. Zamorano; J Blanco Viera  y A. Sadir.

*Ambos autores contribuyeron de igual manera en este trabajo

El Herpesvirus bovino 1 (BoHV1) afecta al ganado y es un componente importante del la enfermedad del complejo respiratorio bovino. BoHV1 es responsable de una amplia variedad de enfermedades clínicas, incluyendo infección del tracto respiratorio superior y conjuntivitis conocido como la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), también produce lesiones del tracto reproductivo, el aborto en vacas preñadas y la infección sistémica en el recién nacido (1). Es responsable de considerables pérdidas económicas debido a la disminución de la producción de leche, la pérdida de peso y los abortos. En Argentina, los índices de seroprevalencia promedian el 55% del ganado bovino (entre 24,8 y 84,1 % según la región y la edad de los animales (3,4). Para el control de la enfermedad se utilizan ampliamente como vacunas virus vivos atenuados o viriones inactivados. El uso de vacunas clásicas con virus inactivo complican el diagnóstico serológico y la determinación de la prevalencia real de la infección. Dado que, el ganado seronegativo para herpesvirus bovino 1 juega un papel importante en el comercio internacional, varios países europeos han erradicado este virus con costos muy altos. En los países con una alta prevalencia de infección, incluyendo los Estados Unidos, el control de IBR se asocia con la vacunación del ganado con vacunas marcadoras. Debido a que existen zonas en  Europa libres de  BoHV1, la capacidad de diferenciar entre animales infectados y vacunados (DIVA) se ha convertido en algo crítico como una herramienta de negociación. Las vacunas marcadoras con virus deleteados ofrecen la ventaja de la deleción de los genes virulentos específicos que no son esenciales para la replicación viral (5). Las vacunas utilizadas en programas de control de BoHV1 utilizan cepas de BoHV1 con delección de la glicoproteína E (6).

En esta investigación se presentan datos sobre el desarrollo nacional de una nueva cepa en base a la cepa BoHV- 1 salvaje “Los Angeles” deleteada en gE (BoHV1?gE?gal) y su uso, ya sea como una vacuna a virus inactivado o como una vacuna marcadora viva atenuada en bovinos. Los resultados demostraron que el virus BoHV1?gE?gal es un candidato a vacuna muy eficaz cuando se lo usa tanto inactivo como vivo atenuado, seguro en cuanto a transmisión horizontal y en hembras preñadas.

Objetivo: Desarrollar una nueva vacuna marcadora contra herpes virus bovino 1 en base a la cepa BoHV1?gE?gal capaz de inducir niveles similares de protección que la vacuna convencional pero con la ventaja adicional de permitir la diferenciación serológica entre animales infectados y vacunados.

Materiales y Métodos

Las cepas BoHV1?gE?gal y BoHV1 salvaje Los Angeles (LA) fueron propagadas en células MDBK.

Generación del virus recombinante BoHV1?gE?gal

Para la obtención del recombinante, se seleccionó la glicoproteína E como blanco de deleción. Para facilitar el proceso de selección, se reemplazó el ORF de gE por el gen de la enzima bgalactosidasa. Para ello, se construyó un vector de recombinación PucLRbgal portando secuencias flanqueantes a ambos lados del gen gE (L y R, a izquierda y derecha de gE, respectivamente), y entre ellas al gen codificante de la bgal. Mediante ensayos de lipofección en MDBK se inoculó el ADN viral de BoHV1 infeccioso junto con el ADN del vector PucLRbgal, se seleccionaron los clones virales expresores de la actividad de la enzima bgal. Los productos de co-transfección se seleccionaron por plaqueo, en condiciones de revelado del gen marcador de expresión beta galactosidasa (b-gal).

 

 

 

 

Caracterización molecular del virus recombinante

Southern blot y Western blot

Los ADNs correspondientes a genoma viral salvaje y recombinante, fueron digeridos con HindIII. Se hibridizó con diferentes sondas específicas (L, R, y gE) previamente obtenidas por PCR y marcadas con 32S.

El antígeno viral purificado (tanto BoHV1 como BoHV1 ?gE?gal) fue sometido a SDS-PAGE, transferido a membrana y enfrentado con anticuerpos monoclonales específicos contra gE y contra gD.

Cinética de crecimiento

Se realizaron, infecciones en T25 con MDBK con la cepa salvaje y cepa recombinante. Los productos de infección fueron cosechados y titulados cada 6 horas, a lo largo de 60 horas.

Formulación de la vacuna inactivada

Con el objetivo de formular la cepa marcadora en una vacuna inactivada, tanto el virus BoHV1?gE?gal como el BoHV1 salvaje (utilizado como vacuna convencional) se inactivaron y formulados en una emulsión agua en aceite.

A. Vacuna inactivada

Se utilizaron 16 bovinos HerefordxAngus y Holando de 8 a 12 meses de edad separados en dos grupos de vacunados inmunizados con 3 ml por vía subcutánea: vacuna BoHV1?gE?gal inactivada (IBoHV1?gE?gal, n=5); vacuna BoHV1 inactivada (IBoHV1; n=5) y un grupo control sin vacunación (n=6). Al momento de la vacunación todos los bovinos fueron seronegativos a BoHV1 (evaluados por seroneutralización y ELISA), se los revacunó a los 21 días post vacunación (dpv) y se desafiaron con el virus infeccioso BoHV1 LA (10 7.5 DICT50/ml) a los 186 dpv.  Todos los experimentos se realizaron siguiendo las recomendaciones de las Guías Internacionales de Cuidado y Uso Animal. El desafío se realizó en boxes de NBS 2 con aire filtrado y presión negativa. Los bovinos fueron sangrados a distintos tiempos, con heparina para ensayos de linfoproliferación y sin heparina para serología. A su vez se tomaron muestras de secreciones nasales a distintos días pos desafío (dpd) y tituladas en MDBK.

B. Vacuna viva atenuada

Se utilizaron 25 bovinos (12 a 18 meses) seronegativos a BoHV1. Se trabajó con 3 grupos de vacunados inmunizados con 4 ml (10 8.25 DICT50%/ml)de la vacuna viva atenuada: por vía intranasal (LBoHV1?gE?gal in); por vía intramuscular (LBoHV1?gE?gal im) y por vía intravenosa (LBoHV1?gE?gaI iv). En el grupo LBoHV1?gE?gal iv, se utilizaron hembras preñadas para evaluar la seguridad de la vacuna viva en cuanto a transmisión vertical. Un grupo fue usado como centinela y no recibió vacuna ni desafío y otro como grupo control de desafío (sin vacunación). A los 3 días de que los animales fueron vacunados se pusieron en contacto con los centinelas. Los signos clínicos y excreción viral fueron controlados durante 42 dpv. Los grupos vacunados con LBoHV1?gE?gal in, im y los controles fueron desafiados por aerosol con 4 ml  de BoHV1 salvaje (10 7.5 DICT50/ml) a los 42 dpv. Se tomaron muestras de sangre e hisopados nasales a distintos dpv y dpd. El grupo LBoHV1?gE?gal iv,, de hembras preñadas, no fue desafiado. Los niveles de excreción viral se evaluaron como log10 DICT50/ml de fluído nasal. Los bovinos fueron examinados clínicamente y los parámetros evaluados incluyeron anorexia, temperatura corporal, conjuntivitis, rinitis y vulvovaginitis. La escala para el estatus de rinitis fue (0=ausencia; 1=serosa leve; 2=serosa severa; 3= seromucosa y 4=mucopurulenta.

Evaluación de seguridad de la vacuna viva atenuada en cuanto a transmisión vertical

Como se mencionó anteriormente en el grupo LBoHV1?gE?gal iv, se seleccionaron 5 vacas preñadas (cursando entre el tercer y sexto mes de gestación) e inoculadas por vía iv con la vacuna viva atenuada. Las vacas fueron evaluadas tanto clínicamente como inmunologicamente durante un período de 42 días junto a los demás grupos experimentales. Durante la experiencia de desafío este grupo no fue expuesto al virus parental BoHV1 salvaje, pero siguieron siendo evaluadas hasta los 370 días post-vacunación incluyendo sus correspondientes pariciones.

Evaluación de la respuesta humoral específica contra BoHV1

Se aplicó la técnica de Enzimo Inmuno Ensayo y seroneutralización ya descriptas (7). Los anticuerpos medidos por ELISA se expresan como log10 de la recíproca de la mayor dilución de suero que da una densidad óptica del 40% del suero control positive leída a A405.  Los títulos de anticuerpos neutralizantes se expresan como log10 de la recíproca de la mayor dilución de suero que protege el efecto citopático.

Evaluación de la respuesta humoral específica para la glicoproteína E de BoHV1.

Para la evaluación de anticuerpos específicos contra gE se utilizó el ELISA Herdchek (IDEXX, Bélgica).

Evaluación de respuesta celular

Las células mononucleares de sangre periférica se purificaron y se ensayaron en un test de linfopropliferacion según lo descripto en (8) y ELISA para cuantificación de IFNg para determinar capacidad de respuesta inmune celular de los animales en estudio La activación de linfocitos T se evalúa como porcentaje de animales positivos en cada grupo que tuvieron índice de estimulación >3.  Los valores de IFNg a los 7dpv se expresan como  pg/ml.

 

Los estudios estadísticos se realizaron por ANOVA y contrastes ortogonales.

 

Resultados

Se construyó un nuevo virus recombinante BoHV1DgEbgal

Con el objeto de desarrollar el virus recombinante se realizó un ensayo de recombinación homóloga entre el DNA del virus BoHV1 salvaje y un plásmido de recombinación que contiene las secuencias homólogas flanqueantes al gen gE y el gen marcador de la bgalactosida, se procedió a la generación de los fragmentos homólogos por amplificación por PCR y a clonados sucesivos en diferentes construcciones de manera tal que se arribó al vector PuLRbgal. Una vez confirmada la estructura del clon PucLR-bgal se utilizó en los ensayos de co-transfección. La selección primaria de clones recombinantes se realizó macroscópicamente mediante un ensayo de revelado de la expresión de la enzima b-galactosidasa, en monocapas de células inoculadas con el producto de la co-transfección. Luego se obtuvieron focos aislados que permitieron seleccionar clones virales individuales. Para la purificación del virus recombinante putativo, se sometió el clon a cinco pasajes sucesivos bajo medio semisólido, en condiciones de revelado de la enzima b-gal. Se corroboró la delección de gE en el virus BoHV1DgEbgal por PCR utilizando primers específicos a gE, utilizando DNA del clon de BoHV1DgEbgal seleccionado y BoHV1 como control. También se realizó la caracterización genética del recombinante BoHV1DgEbgal por Southern Blot digiriendo el  genoma viral con la enzima HindIII y enfrentando los fragmentos a sondas marcadas con 32S de las regiones gE, L, y R en tres ensayos independientes respectivamente, confirmando que solo las sondas L y R hibridizaron tanto con el genoma del virus BoHV1 como con BoHVDgEbgal y como era desperar la sonda E solo hibridizó con el genoma BoHV1 parental, esto permitió confirmar en el “clon a” de BoHV1DgEbgal la ausencia de secuencias codificantes para la gE y que las secuencias flanqueantes L y R permanecieron intactas. Con el objeto de analizar la ausencia de la proteína gE en el “clon a” de BoHV1DgEbgal, se procedió a su detección en un ensayo de Western blot a través del uso de anticuerpos monoclonales anti gD y gE incubados tanto con el perfil de proteínas de BoHV1DgEbgal como de BoHV1 LA. El anticuerpo anto gD reaccionó con ambos virus sine mbargo el anticuerpo monoclonal específico para gE no reaccionó con ninguna de las proteínas de la cepa viral recombinante BoHV1DgEbgal (clon a), mientras que sí lo hizo con la proteína en la cepa BoHV1 LA parental. Esto indica que la cepa viral recombinante no sintetiza la gE, confirmando lo observado a nivel genético.

 

Caracterización de la habilidad replicativa del clon BoHV1DgEbgal

A fines de conocer la viabilidad y la eficiencia replicativa de la cepa BoHV1DgEbgal, se realizó un ensayo de cinética de crecimiento en múltiples pasos en monocapas de células MDBK, en donde se comparó durante 60 horas el comportamiento replicativo en cultivos celulares del clon purificado BoHV1DgEbgal y la cepa BoHV1 parental. Los resultados obtenidos al cosechar y titular cada 6 horas los productos virales de ambos virus reflejaron un crecimiento en cultivo de tejidos de la cepa BoHV1DbgEbgal similar al descripto para la cepa BoHV1 parental. Se detectaron títulos superiores a 107 DICT50 /ml desde las 18 hs post-infección y se mantuvieron hasta el final del ensayo .Por ello la cepa BoHV1DgEbgal resultó una buena candidata para su amplificación en escala y su utilización en la formulación de una vacuna inactivada y también su utilización directa como vacuna viva

 

Caracterización inmunogénica  de la cepa viral  BoHV1DgEbgal.

La cepa BoHV1DgEbgal utilizada tanto como vacuna inactivada o como viva atenuada resultó inmunogénica y protectiva

Con el objeto de evaluar  la integridad de la cepa BoHV1DgEbgal desde el punto de vista inmunogénico se inmunizaron dos grupos de bovinos con vacuna inactivada usando las cepas recombinante BoHV1DgEbgal (IBoHV1?gE?gal)  y parental BoHV1 LA (IBoHV1LA) y 3 grupos con vacuna viva atenuada por via im, iv e in (LBoHV1?gE?gaI im;  LBoHV1?gE?gaI iv, LBoHV1?gE?gaI in). En todos los animales vacunados se detectaron niveles de anticuerpos a partir de los 19 días post-vacunación llegando a títulos de 4 (expresados en log 10) a los 30 dpv en ambos grupos de vacunados con vacuna inactivada y alrededor de 2 en los vacunados con vacuna viva atenuada (im e iv). Los anticuerpos neutralizantes comenzaron a detectarse a los 30 dpv con títulos alrededor de 2 (expresados en log 10) para los vacunados con vacuna inactivada y si bien en los vacunados con vacuna viva atenuada se detectaron antes, éstos alcanzaron niveles de alrededor de 1,5. Al momento del desafío los vacunados con vacunas inactivadas presentaron títulos en promedio de anticuerpos totales de 2,7 en y de 2 para los vacunados con vacuna viva atenuada, en cuanto a los anticuerpos neutralizantes todos los animales vacunados independientemente de la vacuna y vía presentaron al desafío títulos de alrededor de 1. No se registraron anticuerpos neutralizantes en el grupo in, ni en no vacunados y centinelas en el período postvacunación. Los niveles de anticuerpos totales y neutralizantes  inducidos por la vacuna marcadora inactivada  IBoHV1DgEbgal no difieren significativamente de los inducidos por la vacuna IBoHV1 LA convencional.

Los niveles de inmunidad celular específica a los 7 dpv evaluada en término de activación de linfocitos T por el ensayo de linfoproliferación y por secreción de interferón (IFN-g) fueron significativamente mayores en lo animales vacunados con vacuna viva (100%, 60% y 25% de animales positivos en los grupos in,  im e iv respectivamente) que los vacunados con vacuna inactivada (40% y 20% para los vacunados con cepa recombinante o parental respectivamente) y los no vacunados en los que nos se detectó respuesta celular específica en todo el período de estudio.

La vacuna BoHV1DgEbgal es protectiva frente al desafío viral con la cepa salvaje BoHV1 LA

La excreción viral en el grupo de no vacunados fue de 12 días y tuvo un máximo de excreción viral a los 8dpd con un título de 6.1 DICT50%/ml y descarga serosa severa a mucosa durante dos semanas aproximadamente. Los títulos virales excretados por los animales vacunados fueron por un período máximo de 10 días y significativamente menores en todo el período que los controles sin vacunar desafiados (2 logaritmos menos) y en el día pico la diferencia fue de 4 logaritmos menos respecto de los controles.  Todos los animales vacunados con la cepa marcadora BoHV1DgEbgal presentaron síntomas clínicos y rinitis significativamente menor que los controles de desafío. Los vacunados con vacuna inactivada presentaron rinitis serosa leve a severa mientras que los vacunados con la vacuna atenuada tuvieron ausencia de rinitis o serosa leve.

La vacuna BoHV1DgEbgal es eficaz como vacuna marcadora

Solo los animales vacunados con BoHV1 tuvieron anticuerpos contra gE durante todo el periodo de estudio a diferencia de los vacunados con BoHV1DgEbgal en los que se detectaron solo a partir de los 14 dias post desafío en que se los enfrentó con el virus salvaje.

La cepa BoHV1DgEbgal es atenuada

El virus vivo modificado BoHV1DgEbgal mostró una alta atenuación ya que luego de la vacunación los 15 animales que recibieron la vacuna viva exhibieron solo signos clínicos leves de infección (ausencia de rinitis o rinitis serosa) como único signo de enfermedad. Adicionalmente no se detectó virus infeccioso en las secreciones nasales de los animales vacunados con BoHV1DgEbgal independientemente de la ruta de inoculación.

La vacuna BoHV1DgEbgal atenuada es segura en cuanto a capacidad abortigénica y transmisibilidad de la infección por la cepa vacunal

Para determinar la seguridad de la vacuna atenuada en cuanto a su abortigenicidad, se inocularon por vía intravenosa 5 hembras que cursaban el último tercio de la gestación. Todas las hembras tuvieron pariciones normales, con terneros sanos éstos tuvieron título de anticuerpos contra BoHV1 de 1.6 al noveno día de vida indicando la absorción de inmunoglobulinas específicas desde el calostro materno. Aunque la vía IV podría considerarse la más agresiva, BoHV1DgEbgal demostró ser inocuo no causando efectos adversos ni malformaciones o momificaciones. La vacas preñadas que se mantuvieron vacunadas pero sin desafiar para evaluar la seguridad de la vacuna en la preñez tuvieron títulos de anticuerpos contra BoHV1 de 1.6 hasta los 370 dpv, demostrando que la vacuna atenuada administrada por vía IV induce una larga inmunidad.

En cuanto a la transmisibilidad horizontal de la cepa, no se detectó virus infeccioso en las secreciones nasales de animales que actuaron como controles no vacunados y centinelas desde el tercer día post inoculación, a lo largo del período post-vacunal

 

Conclusiones

-Se desarrolló en Argentina una nueva cepa de BoHV1 deleteada en la glicoproteína E portando la enzima ?galactosidasa como gen marcador (BoHV1?gE?gal).

-La cepa BoHV1?gE?gal podría ser amplificada a nivel industrial ya que presentó una cinética de crecimiento similar a la que presenta la cepa BoHV1 LA salvaje en cultivo de tejidos.

-La inmunogenicidad de la cepa BoHV1?gE?gal se mantuvo intacta, comparada con la cepa parental, cuando se la utilizó como un inmunógeno inactivado induciendo niveles de respuesta inmune y protección comparables a los inducidos por la vacuna BoHV1 LA convencional actualmente en uso.

-El virus BoHV1?gE?gal podría ser utilizado además como  vacuna atenuada ya que indujo una buena respuesta inmune específica tanto humoral como celular que resultó protectora frente al desafío viral, independientemente de la vía de inoculación.

-La cepa BoHV1?gE?gal viva atenuada es segura ya que se comprobó que, en las condiciones experimentales no hubo transmisión por contacto a animales vírgenes, ni fue abortigénica.

La vacuna BoHV1?gE?gal es eficaz como una vacuna marcadora ya que, en base a la respuesta de anticuerpos inducidos en los bovinos vacunados con BoHV 1?gE?gal se pudo diferenciar fácilmente tanto de los animales vacunados con BoHV1 como de los bovinos sin vacunar y de los desafiados con BoHV 1.

Este nuevo desarrollo permite contar con una valiosa herramienta para iniciar futuros programas de control e y erradicación en nuestro país.

Este trabajo fue publicado en BMC Veterinary Research 2014, 10:8.

 

 

 

Bibliografia

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Referencias

Áreas geográficas alcanzadas
    • Argentina