09 de Diciembre de 2019
Artículo de divulgación

Optimización de la técnica PMA-QPCR para cuantificación de Escherichia Coli productor de toxina Shiga (STEC) viable en hamburguesas de carne vacuna

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Optimización de la técnica PMA-QPCR para cuantificación de Escherichia Coli productor de toxina Shiga (STEC) viable en hamburguesas de carne vacuna 

 

El PMA (propidium monoazide) es un colorante que puede ingresar a las células con membranas comprometidas e intercalarse entre las hebras de ADN, impidiendo su amplificación por PCR. De esta forma, la señal obtenida por qPCR es atribuible sólo a células viables.

Se optimizó la técnica PMA-qPCR para evaluar viabilidad de STEC en hamburguesas de carne vacuna. Se determinó la concentración mínima de PMA necesaria para inhibir la señal de bacterias muertas y su influencia en la amplificación de ADN de bacterias vivas. Se verificó la capacidad de discriminar bacterias viables en un rango de concentraciones en presencia de bacterias muertas inactivadas por calor, en cultivo y en hamburguesa.

La concentración mínima de PMA necesaria para anular la señal de 5 log UFC/ml de bacterias muertas fue de 100 µM. Se demostró que el PMA no afectaba la señal de bacterias vivas al comparar los valores de Ct (ciclo umbral de señal) obtenidos entre un grupo de muestras con concentraciones crecientes de bacterias vivas (3 a 6 log UFC/ml) y ver que el tratamiento con PMA no afectaba dichos valores. La capacidad de discriminar entre bacterias vivas y muertas se evaluó preparando un grupo de 9 muestras conteniendo 5 log UFC/ml de bacterias muertas combinadas con concentraciones crecientes de células vivas (1 a 7 log UFC/ml), primero en cultivo y luego en homogenato de hamburguesa de carne vacuna. Las muestras tratadas con PMA mostraron una disminución del Ct consistente con el aumento de la concentración de células vivas, habiéndose anulado la señal de las bacterias muertas en cada una de las mezclas. Esto evidencia la capacidad del PMA para discriminar células viables de no viables en cultivo y en hamburguesa.

La técnica PMA-qPCR tiene gran potencial para detectar viabilidad de STEC en hamburguesas que hayan sido tratadas para inactivar este microorganismo.

 

 PMA-OPCR Optimization to quantify viable Shiga toxin producing Escherichia Coli (STEC) in beef burgers

  

PMA (propidium monoazide) is a specific dye that can penetrates compromised bacterial cells and bind to DNA, inhibiting its amplification by PCR. Then, qPCR signal is attributed only to viable cells.

In order to assess viability of STEC in beef burgers, PMA-qPCR technique was optimized. Minimal PMA concentration to inhibit signal from dead cells and its influence in live cells was determined. Ability to distinguish among live and dead cells in mixed samples was also verified, in culture and in beef burgers samples.

Minimal PMA concentration to inhibit signal from 5 log CFU/ml of dead cells was 100 µM. PMA did not affect signal from live cells, comparing Ct values (cycle threshold) obtained from a group of samples with different live cells concentrations (3 to 6 los CFU/ml) with or without PMA treatment. Ability to distinguish among live and dead cells was assessed by preparing a group on 9 samples containing 5 lof CFU/ml of dead cells combined with increasing live cells concentrations (1 to 7 log CFU/ml) first in culture and then in beef burger sample. PMA treated samples showed a Ct decrease that was consistent with the increase of viable cells in the mixture, having a complete inhibition of dead cells signal. These results confirm the PMA capacity to discriminate between viable and non viable cells in culture and in beef burger.

PMA-qPCR technique has a great potential to detect STEC viability in beef burgers that have been treated to inactivate this microorganism.

Referencias

Áreas geográficas alcanzadas
    • Argentina
    • Buenos Aires
    • Hurlingham