Análisis de Laboratorio

Caracterización molecular en Apis mellifera

Servicio de laboratorio del INTA Balcarce destinado a productores apícolas. Mediante técnicas moleculares se puede determinar el origen de las colonias, analizando marcadores moleculares que se encuentran en el ADN mitocondrial. Mediante esta técnica sencilla y rápida el productor apicola y/o el criador de reinas podrá saber con certeza el origen de sus colonias, africanas o europeas.

Grupo o Laboratorio: A COMPLETAR
Sector al que se destina el servicio: Empresas
Unidad de administración: INTA
Servicio pago: Si
Información sobre la forma de pago: El pago se realiza a través de INTEA S.A.
Responsable INTA: María Alejandra PALACIO
Teléfono de contacto: (+54 2266) 439100 Int. 732- 734
Área geográfica que alcanza el servicio:
    • Argentina
    • Buenos Aires
    • Balcarce
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Toma de muestras de abejas:

El productor tomará muestras de individuos, en un número de 10 a 30 del interior de cada colonia de la cual quiera determinar su origen. Las muestras deberán estar identificadas con el número de muestra, fecha y responsable, acompañados con una ficha adjunta (la cual se le enviará al productor cuando requiera la realización del servicio).

Las abejas de cada muestra se conservaran en un frasco, preferentemente los de análisis clínicos, en etanol (alcohol común). Serán remitidas al laboratorio para los análisis moleculares.

 

Protocolo

Se realizará la extracción de ADN total mediante una técnica de alta concentración salina, amplificándose luego por medio de la técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction-Reacción en Cadena de la Polimerasa) la región intergénica citocromo oxidasa I-citocromo oxidasa II (COI-COII).

Luego se procede a la digestión con la enzima de restricción Hinf I, observando el patrón de bandas que se obtiene de la digestión en gel de agarosa al 4% y poder determinar el haplotipo que porta la muestra.

Los geles, de extracción, amplificación y digestión, son observados en un digitalizador de imágenes y las imágenes almacenadas en archivos tipo JPEG pero se pueden observar en un transiluminador común (de luz U.V. o luz azul según el tipo de colorante utilizado).

 

Metodología

La extracción de ADN se realiza mediante el protocolo de extracción individual de ADN total de insectos de Baruffi et al del año 1995.

  1. Se diseca el tórax y se coloca en un tubo de 1,5 ml.
  2. Se agregan 200 ?l de buffer de extracción.
  3. Se tritura el torax, se agregan 200 ?l mas de buffer y se incuba a 60-65 °C 30 minutos.
  4. Se agrega el acetato de Potasio y se incuba 30 minutos a 4°C y luego se centrífuga 15 min a 14-15000 RPM a 4°C.
  5. Se recupera el sobrenadante y se precipita el ADN con etanol. Se centrífuga 15 min a 14-15000 RPM a t° ambiente.
  6. El pellet se lava con alcohol 70% y luego 100%.
  7. Se seca el pellet en block de calor a 50 °C o al vacío.
  8. Se resuspende el ADN en TE o agua bidestilada.
  9. El ARNt presente se digiere con ARNasa 30 min a 37°C.
  10. El ADN extraído se analiza por electroforesis en gel de agarosa 0,8%, evaluando calidad y cantidad con marcador pGEM.

 

Equipamiento

  • Estufa o baño termostático
  • Centrifuga refrigerada
  • Cuba electroforética y su respectiva fuente de poder
  • Material de laboratorio (morteros, pisones, probetas, pisetas, etc)
  • Reactivos (Buffer de extracción: NaCl 100 mM, Sacarosa 200 mM, Tris-HCl pH 9,1 100mM, EDTA 50 mM, SDS 0,5% y Proteinasa K 100 ?g/ml., Acetato de Potasio 8M 50 ?l, etanol 1 ml, alcohol 70% 500 ?l, alcohol 100% 500 ?l, TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA pH 8, 1mM) 50 ?l aunque también se puede utilizar agua bidestilada, ARNasa 1 mM 1 ?l.)
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